【摘要】  菌种保藏是根据微生物的生理、生化特点，人工创造条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态，达到不死、不变异、不污染、在长期间内保持原有生产性状和生命活力，以便于生产使用。保藏条件须低温、干燥、缺氧，不同微生物适用的保藏方法不同，本文根据啤酒酵母的特性，通过采用不同的保藏方法试验、对比，并对不同方法保藏后的酵母的活性变化情况进行试验，提出啤酒酵母的最佳保藏方法。

【关键词】 啤酒酵母  保藏   特性  稳定性

啤酒酵母的特性及质量直接关系到发酵正常与否及啤酒的风味。生产中，由于菌种保藏方法不当，容易引起酵母形态变异、发酵缓慢、死亡率高、酵母活性差等现象，严重影响到到啤酒的质量及风味的稳定性。因此啤酒厂菌种保藏工作是一项非常重要的工作。

1  啤酒酵母的保藏方法

1.1  定期移植保藏法

定期移植保藏法也叫传代保藏法,，包括斜面培养、液体培养、穿刺培养等。啤酒酵母一般采用斜面保藏法。

1.1.1  方法与步骤

将麦汁培养基制备好，装试管斜面，杀菌后摆斜面，置空气中使培养基表面的水滴晾干，将菌种接种在培养基上，待菌落生长完好后，置4℃冰箱中保藏，每隔一段时间移植一次，再将新长好的斜面菌种继续保藏。

1.1.2  要求的条件

培养基：采用8度麦芽汁琼脂或麦芽汁酵母琼脂培养基

培养温度：25-28℃恒温培养

培养时间：3天

保藏的温度及移接时间：于4-6℃保存。每隔3-4个月移接1次。

1.1.3  注意事项

1.1.3.1  斜面培养基应少含糖分，有机氮多些，一般麦汁浓度为8度，这样既满足了菌种生长繁殖需要的营养，又防止产酸过多而影响菌种的保藏。

1.1.3.2  斜面培养基制备后，应置空气中2-3天，把培养基表面及试管壁上的水珠晾干，防止水珠滴到菌落上，把菌落弄散。

1.1.3.3  在保存期间应定期检查存放冰箱的温度、湿度及试管的棉花是否有长霉现象，如发现异常则立即取出该管重新移植，并经培养后补上空缺。

1.1.3.4  大量保存菌种每次移植时，各菌株号一定要细心核对准确无误，才能进一步进行培养，每次移植后应与原保藏的菌株各菌种顺序号逐管逐号对照，检查其培养特征，确定无误再进行保藏。

1.1.3.5  斜面保存的菌种，一般每株应保藏相继的三代培养物，若发生特性变异，才便于比较，查找原因。

1.2  液体石蜡保藏法

液体石蜡或称矿油，用它保藏菌种比较简便易行，它是定期移植保藏和穿刺培养的辅助方法，此法是在需要的培养物上覆盖一层已灭菌的液体石蜡，目的是抑制生物代谢，推迟细胞老化，防止培养基水分蒸发，以延长微生物的寿命。

1.2.1  方法与步骤

1.2.1.1  液体石蜡的准备：选用优质无色、中性、比重为0.8-0.9克/厘米³的液体石蜡，装入三角瓶中，加棉塞，用防潮纸包好，灭菌后取出，置40℃温箱蒸发水份，或于110-170℃烘箱烘水份，经无菌检查后备用。

1.2.1.2  菌种培养：将需要保藏的啤酒酵母菌种，接种在适宜的培养基斜面上培养2-3天，以得到健壮的菌体细胞。

1.2.1.3  灌注石蜡油：在无菌条件下，用无菌吸管吸取已灭菌过的液体石蜡油，注入已培养好的新鲜的斜面菌体细胞上，以高于斜面顶端1厘米为准，使菌体与空气隔绝。

1.2.1.4  保藏：将已灌注液体石蜡油的菌种斜面，以直立状态低温（5℃左右）处保藏。

1.2.1.5  恢复培养：在移接或再培养时，先沿试管壁倒去附在菌体上的液体石蜡，将菌体移接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。

1.2.2  要求条件：培养过程中所要求的条件同斜面培养法。保藏场所经干燥为宜，以免棉塞生霉。

1.2.3  注意事项

1.2.3.1  液体石蜡易燃，必须防止火灾。另外由石蜡封藏的菌体需要移植时，接种针上带有石蜡和菌体，遇火容易飞溅、爆发，所以要严防感染。

1.2.3.2  所用液体石蜡必须加以选择，杂质多，易引起菌种变异或死亡。

1.2.3.3  保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充灭菌的液体石蜡。

1.3  冷冻真空干燥保藏法

冷冻真空干燥保藏法又称低压冷冻干燥法，是指液体样品在冻结状态下使其中水份升华，最后达到干燥。低温、干燥和隔绝空气是保藏菌种的几个重要因素。在这些条件下微生物的生命活动将处于休眠状态。

1.3.1  方法与步骤

1.3.1.1  安瓿管的准备：将安瓿管先用毛刷在肥皂水内刷洗一遍，冲洗干净后，浸泡在2%的盐酸中，8-10小时后取出，用自来水冲洗到中性后，再用蒸馏水冲洗2-3次，置烘干箱烘干后，将印有菌号、制作日期的标签放入安瓿管中，塞好棉塞，用防潮纸包好，蒸汽灭菌备用。同时准备毛细滴管、移液管，用防潮纸包好，同安瓿管一起杀菌。

1.3.1.2  保护剂的制备：保护剂是一种分散细胞的溶媒，它在微生物细胞冷冻真空干燥的脱水过程中，可代替结合水，起保护细胞膜的作用。保护剂须具备两个基本特点：具有保持悬浮的生物处于生活状态的能力和使生物的细胞经冻干和保藏后再恢复培养时无困难。用于冷冻真空干燥的保护剂种类很多，保藏啤酒酵母的保护剂一般选用10%的脱脂乳+1%谷氨酸钠。

1.3.1.3  菌种的培养：将需要保藏的啤酒酵母菌种，接种在适宜的培养基斜面上培养2-3天，以得到健壮的菌体细胞。

1.3.1.4  制备菌悬液和分装：用固体培养基培养的菌种，制备菌悬液时可直接将保护剂加到斜面培养基上，再用接种环把培养基上的细胞刮下，使其均匀地悬浮在保护剂内，使制得的菌悬液含细胞数在10^8-10个/毫升为宜。菌悬液制备后应及时用带有乳胶头帽的长毛细滴管，马上将菌悬液分装在灭好菌的安瓿管内，以免溶解生物代谢所分泌到培养基内的不需要的物质而影响保藏效果。每支安瓿管的装量在0.05-0.2毫升左右。

1.3.1.5预冻：装好后放入-35℃以下冰箱预冻1小时，使菌液完全冻结成冰。

1.3.1.6真空干燥：预冻后将安瓿管放入真空箱内，按设备要求开动真空泵进行干燥，在开启真空泵后应使真空度在15分钟内达到66.5Pa，随后逐渐达到26.6-13.3 Pa，在这样的条件下，样品将保持冻结状态，水分不断升华，干燥能顺利进行。

1.3.1.7熔封：干燥后分两次封管口。首先将安瓿管的上部、棉塞的下部用火焰烧熔，拉成细颈，再将安瓿管装到多岐管上，开启真空泵，当真空度达到1.33 Pa时，再继续抽气数分钟，用火焰在细颈处熔封。

1.3.1.8保藏：安瓿管可在室温存放，也可放4-10℃低温存放，但是温度应保持恒定，要避光。

1.3.1.9恢复培养：冻干的菌种经贮藏后，需用时可在无菌室内开启安瓿管进行恢复培养。其骤如下：先用锉刀将安瓿管上部横锉一道痕迹，用烧热的玻璃棒置痕迹处，安瓿管壁上立即出现裂纹，当空气进入后再行打开，用无菌试管将麦汁培养基加入安瓿管中，溶化干燥的样品，摇匀，再用无菌吸管吸取溶化的液体并移入适宜的培养基上，在最适温度下培养。

1.4  液氮保藏法

液氮保藏法是将保存的菌种用保护剂制成菌悬液封于安瓿管内，经控制速度冻结后，贮藏在-150至-196℃的液态氮超低温冰箱中。

1.4.1  方法与步骤

1.4.1.1  安瓿管的制备：选用能经受温度的突然变化而不致于破裂、容易用火焰熔封管口、恢复培养时容易打开的安瓿管。安瓿管选好后，洗刷干净，贴好菌号，塞上棉塞，蒸汽灭菌后，烘干备用。

1.4.1.2  加保护剂：液氮保藏一般要添加保护剂。保护剂一般用脱脂乳、甘油蒸馏水溶液、二甲基矾蒸馏水溶液作保护剂。保护剂先加在安瓿管内后灭菌备用。

1.4.1.3  菌种培养：需保藏的菌种先在麦汁琼脂斜面培养基上培养2-3天，以得到健壮的菌体细胞，制成菌悬液，再将菌悬液加到容有保护剂并已灭菌的安瓿管内。

1.4.1.4  冷冻和保藏：将菌悬液加到安瓿管后，用火焰将安瓿管上部熔封，浸入水中检查有无漏洞，然后将已封口的安瓿管置冻结器内，在控制冻结速度为每分钟下降1℃的条件下，使样品冻结到-35℃。再用干冰和乙二醇冷冻至-78℃后，立即移到液态氮冰箱中保存，箱内温度为：气相中为-150℃，液相氮内-196℃。为防止安瓿管在取出时破裂，可将安瓿管置液氮冰箱内的气相中保藏。

1.4.1.5  恢复培养：保藏的菌种，如需用时，将安瓿管由冰箱取出，立即置38-40℃水浴中摇动，直到内部的结冰全部融化为止，以无菌操作开启安瓿管，将菌种移到麦汁培养基上培养。

1.4.2  注意事项

1.4.2.1  若安瓿管熔封不严密或稍有破裂，在保藏期间液氮就会渗入安瓿管内，使用时，液氮就会从安瓿管内逸出，由于外面的温度高，液氮就会急速气化，膨胀而发生爆炸。因此安瓿管必须严格密封，同时在安瓿管恢复培养时也应该采取一些相应措施，如在水下融解，操作时操作人员应戴皮手套和面罩。

1.4.2.2  处理液氮时，应仔细操作。液氮与皮肤接触极易“冷烧”，应该小心操作。氮本身无色无臭，在较小的房间里操作应注意防止窒息，液氮容器应放置在通风良好的地方。

1.4.2.3  在保藏过程中，要做到取出安瓿管时不影响其它安瓿管的保藏。

2．啤酒酵母不同保藏方法保藏效果的比较

2.1  同一株啤酒酵母采用不同保藏方法酵母存活情况的试验

将经过分离筛选后的同一株啤酒酵母，采用移植保藏法、液体石蜡保藏法、冷冻真空干燥保藏法、液氮保藏法四种不同保藏方法，对保存3个月、半年、一年、两年、三年、四年、五年不同保藏时间酵母的存活率进行检测，试验结果见表1。
表1
保存时间 斜面保藏法 液体石蜡保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮保藏法
3个月 97.5% 96.2% 96.3% 96.8%
半年 96.2% 93.7% 96.0% 96.3%
一年 培养基干涸 91.7% 94.3% 95.7%
两年 培养基干涸 89.3% 93.4% 95.7%
三年 / 85.7% 92.6% 95.7%
四年 / 80.6% 91.2% 95.7%
五年 / 62.7% 90.0% 95.7%
从表1可看出：斜面保藏法保藏时间不能超过半年，半年后培养基基本干涸，酵母死亡；液体石蜡保藏法保藏时间在1年内酵母存活率还较高，两年后酵母存活率明显下降；冷冻真空干燥保藏法和液氮保藏法保藏时间在五年内酵母存活率变化小，存活率在90%以上。
2.2  同一株啤酒酵母采用不同保藏方法酵母特性变化情况的试验
将经过分离筛选后的同一株啤酒酵母，测酵母的大小、形态、死灭温度、凝聚性、发酵能力等14个指标后通过移植保藏法、液体石蜡保藏法、冷冻真空干燥保藏法、液氮保藏法四种不同保藏方法保存五年后，再对不同保藏方法的酵母特性进行检测、试验，试验结果见表2。
表2
酵母特性 原  种 移植
保藏法 液体石蜡保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮保藏
细胞大小
（μm） 短轴：6.3
长轴：8.2 短轴：5.9
长轴：8.6 短轴：6.0
长轴：8.4 短轴：6.1
长轴：8.0 短轴：6.2
长轴：8.3
长短轴比 1：1.30 1：1.46 1：1.40 1：1.31 1：1.33
细胞形态 卵圆形、大小形态均一 长卵圆形、大小形态不均一 卵圆形、大小形态不均一 卵圆形、大小形态均一 卵圆形、大小形态均一
峰值酵母数
（个/ml） 9.82×107 8.65×107 8.96×107 9.22×107 9.53×107
凝聚性（本斯值）(ml) 2.65 2.75 2.70 2.65 2.65
死灭温度(℃) 53 53 53 53 53

发酵能力 起酵快,10℃发酵4天,发酵度60%以上 起酵慢,10℃发酵4天,发酵度58% 起酵快,10℃发酵4天,发酵度59%以下 起酵快,10℃发酵4天,发酵度60%以上 起酵快,10℃发酵4天,发酵度60%以上
极限发酵度（%） 71.1 69.8 70.3 70.9 71.0
双乙酰峰值（ppm） 0.25 0.35 0.31 0.26 0.26
成品酒双乙酰含量（ppm以12度计） 0.05以下 0.05以下 0.05以下 0.05以下 0.05以下
乙醛峰值（ppm） 39.1 59.0 45.4 40.3 40.1
成品酒乙醛含量（ppm以12度计） 5.2
 8.5
 7.8
 5.7
 5.5

α-氨基氮同化率(%) 69.8 63.1 65.3 68.9 69.3

酵母稳定性 发酵9代,酵母性能及风味没有显著变化 发酵9代,酵母性能及风味有显著变化 发酵9代,酵母性能及风味不稳定 发酵9代,酵母性能及风味没有显著变化 发酵9代,酵母性能及风味没有显著变化
注：所有试验使用的麦汁采用相同成份的12度麦汁。

3．结论与讨论

3.1  斜面保藏法操作简便易行，不需要特殊设备，能随时观察所保藏的菌株是否死亡、变异、退化或污染杂菌，同时酵母的存活率高。但斜面保藏法保藏在冰箱的菌种保存时还有一定的代谢活性，保存时间不能太长，且培养基易干涸，须不断移接，一般3个月须移接1次，这样酵母传代多，菌种易变异，酵母特性不稳定，从而影响到发酵及啤酒的风味稳定性，斜面保藏法只适于酵母的短期保藏，不适于长时间的保藏。

3.2  液体石蜡保藏法的液体石蜡可防止培养基的水分蒸发使培养干涸而引起菌体死亡，还可阻止氧气进入，使好气菌不能继续生长，以延长菌种的保藏时间。但由于啤酒酵母是兼性好氧菌，若采用液体石蜡保藏法保藏，酵母还是有一定的代谢活性，虽然保藏时间会比斜面保藏法长，但酵母菌种还是易变异，酵母特性不稳定。同时若液体石蜡质量不好或处理不当也会使酵母形态改变，影响酵母的特性。液体石蜡保存方法不适合啤酒酵母菌种的长期保存，长期保存后死亡率高，菌种容易发生退化、突变等现象。

3.3  采用液氮保藏法保藏啤酒酵母酵母存活率高，保藏时间长，保藏五年以上，酵母存活率在95%以上，且酵母活性强，不易退化，使用后发酵较稳定，啤酒的风味稳定性好，是目前较理想的保藏方法。但液氮保藏法设备成本高，操作技术含量高一般适合于高校或科研机构，不适于啤酒厂采用。

3.4  真空冷冻干燥保藏法，酵母酵母存活率比较高，保藏时间长，酵母不易退化，它在菌种保藏方面优于液体石蜡保存方法，保藏成本低于液氮保存方法。适于啤酒厂采用，是大多数啤酒厂选用的最佳酵母保藏方法。